基于水性的生物组织透明化试剂盒及组97国际游戏app-织透明化方法与流程

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　　1.本技术涉及组织透明化技术领域，尤其是涉及一种基于水性的生物组织透明化试剂盒及组织透明化方法。

　　2.目前，生物组织固有的三维属性使得生命科学的研究日益依赖于空间信息的完整解读：如脑部神经投射、血管分布以及肿瘤微环境研究等，均需围绕三维空间信息才能得以进行客观分析及后续研究。但是生物组织的不均匀性，如各层组织中含有的水、脂质和蛋白质等各种分子造成光散射，以及细胞中的各类色素成分造成的光吸收，不仅限制了成像深度，而且大大降低了图像的对比度，想要对组织进行三维成像仍是个很大的挑战。

　　3.组织透明化技术应用水溶性有机溶剂或者亲水性试剂，对固定组织通过灌注、浸泡或电泳等处理方式，去除造成光散射和光吸收的成分，然后应用高折射率介质使组织达到近乎一致的折射率，从而使组织达到光学透明，进而增加成像深度和图像对比度。

　　4.目前组织透明化技术主要有水性、油性及基于水凝胶的三大类组织透明化方法。其中油性的透明化方法(包括idisco，udisco，3disco，babb和pegasos等)速度快、组织硬、透明化程度较高，但是刺激性强、组织收缩、容易使荧光淬灭。基于水凝胶的透明化方法(包括clarity，shield和pact等)对蛋白质、核酸保护效果好，通常需要专用辅助设备，且所用配套的商业试剂相对昂贵、对操作有一定要求。水性的组织透明化方法(如seedb,fruit,scale和cubic等)则生物相容性好、操作安全，具备满足现代医学检测要求的潜力，但是往往透明化效率低、程度有限。

　　5.现有的透明化方法各有优缺点，因此需要一种符合现代医学检测要求的组织透明化方法，即具有高效、快速、操作简单、使用安全等优点，又能适用于各类组织样本透明化的通用性试剂。

　　6.本技术的目的在于提供一种基于水性的生物组织透明化试剂盒及组织透明化方法，在一定程度上解决了现有技术中存在的一种符合现代医学检测要求的组织透明化方法的技术问题。

　　8.试剂一，所述试剂一包括尿素、四乙二胺以及triton x-100；

　　9.试剂二，所述试剂二包括n-正丁基二乙醇胺以及triton x-100；

　　11.在上述技术方案中，进一步地，所述试剂一所包括的尿素、四乙二胺以及triton x-100的质量-体积浓度分别为25-35、10-30以及1-5，且优选为30、30以及5。

　　12.在上述任一技术方案中，进一步地，所述试剂二所包括的n-正丁基二乙醇胺以及triton x-100的质量-体积浓度分别为10-20以及10-30，且优选为15以及15。

　　13.在上述任一技术方案中，进一步地，所述试剂三所包括的安替比林、烟酰胺以及n-正丁基二乙醇胺的质量-体积浓度分别为35-50、20-40以及1-5，且优选为50、20以及1。

　　14.本技术还提供了一种组织透明化方法，应用于上述任一技术方案所述的基于水性的生物组织透明化试剂盒，因而，具有该基于水性的生物组织透明化试剂盒的全部有益技术效果，在此，不再赘述。

　　19.步骤201、样本经过1xpbs洗涤后，放入所述试剂一中进行孵育，在预设温度下缓和震荡；

　　20.步骤202、将样本转移至所述试剂一中，在预设温度下缓和振荡，且每隔预设时间更换一次所述试剂一。

　　23.步骤204、样本经过洗涤后，放入所述试剂二中进行孵育，在预设温度下，缓和震荡；

　　24.步骤205、将样本转移至所述试剂二中，在预设温度下，缓和振荡，且按照每隔预设时间更换一次所述试剂二。

　　27.步骤207、样本洗涤后，放入所述试剂三中进行孵育，在预设温度下缓和震荡；

　　28.步骤208、样本经过孵育后，将样本转移至所述试剂三中，在预设温度下，缓和振荡，匹配直至样本透明。

　　30.步骤101、灌注、取材：麻醉小鼠后，先用ice cold 1xpbs灌注心脏，然后用ice cold 4％pfa灌流小鼠，直到血液灌流干净；

　　31.步骤102、pfa后固定：样本放在4％pfa中，而后在预设温度下，进行缓和震荡过夜。

　　32.在上述任一技术方案中，进一步地，所述组织透明化方法还包括如下步骤：

　　33.步骤300、样本成像：样本折射率匹配后，低熔点琼脂糖和所述试剂三充分混合并放至离心管中，直到琼脂糖粉末分布在溶液中；

　　34.加热离心管：将离心管放置在微波炉内加热预设时间，重复几次，直至溶液沸腾；

　　35.将凝胶溶液和样本移入容器中，移入的凝胶溶液用量至少达到样本厚度；

　　40.本技术提供的基于水性的生物组织透明化试剂盒，共包含三大试剂：试剂一为组织快速脱色脱脂液，主要成分包含有尿素、四乙二胺、triton x-100等试剂，样品经过该试

　　剂处理后会快速变成半透明状态；试剂二为组织进一步脱色脱脂液，主要成分包含有n-正丁基二乙醇胺、triton x-100等试剂，可以使样本进一步进行脱色和脱脂；试剂三为组织透明液，主要成分包含有安替比林、烟酰胺、n-正丁基二乙醇胺等试剂，该试剂用于组织的折射率匹配，经过该试剂处理后可以快速透明，而且透明化后的组织利用光片显微镜可以做完整的三维成像。

　　41.利用本方法可以使得组织快速透明化，而且透明化后的组织利用光片显微镜可以做完整的三维成像，而且操作简单、方便。

　　42.为了更清楚地说明本技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

　　43.图1为小鼠脑透明化前和透明化后图片(其中，(a1)为透明化前，(b1)为透明化后)；

　　47.图5为小鼠心脏透明化前和透明化后图片(其中，(a2)为透明化前，(b2)为透明化后)；

　　49.图7为小鼠胃透明化前和透明化后图片(其中，(a3)为透明化前，(b3)为透明化后)；

　　51.图9为小鼠肾脏透明化前和透明化后图片(其中，(a4)为透明化前，(b4)为透明化后)；

　　53.图11为小鼠肝脏透明化前和透明化后图片(其中，(a5)为透明化前，(b5)为透明化后)；

　　54.图12为小鼠睾丸透明化前和透明化后图片(其中，(a6)为透明化前，(b6)为透明化后)；

　　55.图13为小鼠肠透明化前和透明化后图片(其中，(a7)为透明化前，(b7)为透明化后)；

　　56.图14为小鼠脾脏透明化前和透明化后图片(其中，(a8)为透明化前，(b8)为透明化后)。

　　57.下面将结合附图对本技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。

　　58.通常在此处附图中描述和显示出的本技术实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本技术的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本技术的范围，而是仅仅表示本技术的选定实施例。

　　59.基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。

　　60.在本技术的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本技术和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本技术的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

　　61.在本技术的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本技术中的具体含义。

　　62.下面参照图1至图11描述根据本技术一些实施例所述的基于水性的生物组织透明化试剂盒及组织透明化方法。

　　64.利用本技术提供了一种基于水性的生物组织透明化试剂盒及组织透明化方法对小鼠的脑组织进行透明化处理，详细步骤如下：

　　65.步骤100、样本固定：灌注、取材：麻醉小鼠后，先用ice cold1xpbs(指的是现有技术中的冰冷的缓释液，具体是指温度在0-4℃的缓释液)灌注心脏，然后用ice cold 4％pfa(冷的4％多聚甲醛固定液)灌流小鼠，直到血液灌流干净，且其中的样品指的就是小鼠脑；

　　66.pfa后固定：样本放在4％pfa中，而后在4℃条件下，进行缓和震荡过夜(12-24小时，是在摇床上进行的)，例如用1xpbs洗涤样本2-3次，每次2小时，50rpm也即摇床的转速。

　　67.步骤200、样本透明化：将样品依次放入所述试剂一、所述试剂二以及所述试剂三中分别进行缓和震荡预设时间，其中，试剂一为所述试剂一包括尿素、四乙二胺以及triton x-100(聚乙二醇辛基苯基醚)，且质量-体积浓度分别为30、30以及5，单位为g/ml；试剂二包括n-正丁基二乙醇胺以及triton x-100，且质量-体积浓度分别为15以及15，单位为mg/l；试剂三包括安替比林、烟酰胺以及n-正丁基二乙醇胺，且质量-体积浓度分别为50、20以及1，单位为mg/l，且注意：上述出现的质量-体积浓度是指用单位体积(1毫升)溶液中所含的溶质质量数来表示的浓度叫质量-体积浓度，以符号g/ml表示。例如：1ml含铬废水中含铬的质量为2克，则铬的质量-体积浓度为2克/毫升(g/ml)，也即质量-体积浓度＝溶质的质量数(克)/溶液的体积(毫升)；

　　69.样本经过1xpbs(是指现有技术中的常温状态下的缓冲液)洗涤后，放入10ml的1/2的所述试剂一中进行孵育，37℃条件下缓和震荡至少6小时；

　　70.将样本转移至10ml的所述试剂一中，37℃条件下缓和振荡6天，且每2天更换一次，共更换3次。

　　71.将样本转移至20ml的1xpbs中，室温缓和振荡洗涤2小时，重复洗涤至少3次；

　　72.样本经过洗涤后，放入10ml的1/2的所述试剂二中进行孵育，37℃条件下缓和震荡至少6小时；

　　73.将样本转移至10ml的所述试剂二中，37℃条件下缓和振荡6天，且每2天更换一次，共更换3次；

　　74.将样本转移至20ml的1xpbs中，室温缓和振荡洗涤2小时，重复洗涤至少3次；

　　75.样本洗涤后，放入10ml的1/2的所述试剂三中进行孵育，37℃条件下缓和震荡至少6小时；

　　76.样本经过孵育后，将样本转移至10ml的所述试剂三中，37℃条件下缓和振荡2天，直至样本透明。

　　78.步骤300、样本成像：样本折射率匹配后，以wt/vol计，将2％的所述试剂三和低熔点琼脂糖充分混合并放至离心管中，直到琼脂糖粉末分布在溶液中；

　　79.加热离心管：将离心管放置在微波炉内加热预设时间，重复几次，直至溶液沸腾；

　　80.将凝胶溶液和样本移入容器中，移入的凝胶溶液用量至少达到样本厚度；

　　83.使用光片显微镜对样本进行完整三维成像。结合以上所述的方法以及图1至图4所示可知，组织透明化试剂盒共包含三大试剂：试剂一为组织快速脱色脱脂液，主要成分包含有尿素、四乙二胺、triton x-100等试剂，样品经过该试剂处理后会快速变成半透明状态；试剂二为组织进一步脱色脱脂液，主要成分包含有n-正丁基二乙醇胺、triton x-100等试剂，可以使样本进一步进行脱色和脱脂；试剂三为组织透明液，主要成分包含有安替比林、烟酰胺、n-正丁基二乙醇胺等试剂，该试剂用于组织的折射率匹配，经过该试剂处理后可以快速透明，而且透明化后的组织利用光片显微镜可以做完整的三维成像。可见，利用本试剂盒和方法可以使得小鼠脑组织快速透明化，而且透明化后的组织利用光片显微镜可以做完整的三维成像，可见，经过本试剂盒和方法获得的透明组织完全能够满足三维成像的需求。

　　85.利用本技术提供了一种基于水性的生物组织透明化试剂盒及组织透明化方法对小鼠的心脏组织进行透明化处理，详细步骤如下：

　　86.步骤100、样本固定：灌注、取材：麻醉小鼠后，先用ice cold1xpbs灌注心脏，然后用ice cold 4％pfa灌流小鼠，直到血液灌流干净；

　　87.pfa后固定：样本放在4％pfa中，而后在4℃条件下，进行缓和震荡过夜(12-24小时，是在摇床上进行的)，例如用1xpbs洗涤样本2-3次，每次2小时，50rpm也即摇床的转速。

　　88.步骤200、样本透明化：将样品依次放入所述试剂一、所述试剂二以及所述试剂三中分别进行缓和震荡预设时间，其中，所述试剂一、所述试剂二以及所述试剂三与实施例一相同，结合上述，样本透明化的详细步骤如下：

　　89.样本经过1xpbs洗涤后，放入10ml的1/2的所述试剂一中进行孵育，37℃条件下缓和震荡至少6小时；

　　90.将样本转移至10ml的所述试剂一中，37℃条件下缓和振荡4天，且每2天更换一次，

　　91.将样本转移至20ml的1xpbs中，室温缓和振荡洗涤2小时，重复洗涤至少3次；

　　92.样本经过洗涤后，放入10ml的1/2的所述试剂二中进行孵育，37℃条件下缓和震荡至少6小时；

　　93.将样本转移至10ml的所述试剂二中，37℃条件下缓和振荡4天，且每2天更换一次，共更换2次；

　　94.将样本转移至20ml的1xpbs中，室温缓和振荡洗涤2小时，重复洗涤至少3次；

　　95.样本洗涤后，放入10ml的1/2的所述试剂三中进行孵育，37℃条件下缓和震荡至少6小时；

　　96.样本经过孵育后，将样本转移至10ml的所述试剂三中，37℃条件下缓和振荡约2天左右，直至样本透明。

　　98.步骤300、样本成像：样本折射率匹配后，以wt/vol计，将2％的所述试剂三和低熔点琼脂糖充分混合并放至离心管中，直到琼脂糖粉末分布在溶液中；

　　99.加热离心管：将离心管放置在微波炉内加热预设时间，重复几次，直至溶液沸腾；

　　100.将凝胶溶液和样本移入容器中，移入的凝胶溶液用量至少达到样本厚度；

　　104.结合以上所述的方法以及图5和图6所示可知，利用本试剂盒和方法可以使得心脏组织快速透明化，而且透明化后的组织利用光片显微镜可以做完整的三维成像。

　　106.利用本技术提供了一种基于水性的生物组织透明化试剂盒及组织透明化方法对小鼠的胃组织进行透明化处理，详细步骤如下：

　　107.步骤100、样本固定：灌注、取材：麻醉小鼠后，先用ice cold1xpbs灌注心脏，然后用ice cold 4％pfa灌流小鼠，直到血液灌流干净；

　　108.pfa后固定：样本放在4％pfa中，而后在4℃条件下，进行缓和震荡过夜(12-24小时，是在摇床上进行的)，例如用1xpbs洗涤样本2-3次，每次2小时，50rpm也即摇床的转速。

　　109.步骤200、样本透明化：将样品依次放入所述试剂一、所述试剂二以及所述试剂三中分别进行缓和震荡预设时间，其中，所述试剂一、所述试剂二以及所述试剂三与实施例一相同，结合上述，样本透明化的详细步骤如下：

　　110.样本经过1xpbs洗涤后，放入10ml的1/2的所述试剂一中进行孵育，37℃条件下缓和震荡至少6小时；

　　111.将样本转移至10ml的所述试剂一中，37℃条件下缓和振荡2天，且每2天更换一次，共更换1次；

　　112.将样本转移至20ml的1xpbs中，室温缓和振荡洗涤2小时，重复洗涤至少3次；

　　113.样本经过洗涤后，放入10ml的1/2的所述试剂二中进行孵育，37℃条件下缓和震荡至少6小时；

　　114.将样本转移至10ml的所述试剂二中，37℃条件下缓和振荡2天，且每2天更换一次，

　　115.将样本转移至20ml的1xpbs中，室温缓和振荡洗涤2小时，重复洗涤至少3次；

　　116.样本洗涤后，放入10ml的1/2的所述试剂三中进行孵育，37℃条件下缓和震荡至少6小时；

　　117.样本经过孵育后，将样本转移至10ml的所述试剂三中，37℃条件下缓和振荡约1天左右，直至样本透明。

　　119.步骤300、样本成像：样本折射率匹配后，以wt/vol计，将2％的所述试剂三和低熔点琼脂糖充分混合并放至离心管中，直到琼脂糖粉末分布在溶液中；

　　120.加热离心管：将离心管放置在微波炉内加热预设时间，重复几次，直至溶液沸腾；

　　121.将凝胶溶液和样本移入容器中，移入的凝胶溶液用量至少达到样本厚度；

　　125.结合以上所述的方法以及图7和图8所示可知，利用本试剂盒和方法可以使得胃组织快速透明化，而且透明化后的组织利用光片显微镜可以做完整的三维成像。

　　127.利用本技术提供了一种基于水性的生物组织透明化试剂盒及组织透明化方法对小鼠的肾脏组织进行透明化处理，详细步骤如下：

　　128.步骤100、样本固定：灌注、取材：麻醉小鼠后，先用ice cold1xpbs灌注心脏，然后用ice cold 4％pfa灌流小鼠，直到血液灌流干净；

　　129.pfa后固定：样本放在4％pfa中，而后在4℃条件下，进行缓和震荡过夜(12-24小时，是在摇床上进行的)，例如用1xpbs洗涤样本2-3次，每次2小时，50rpm也即摇床的转速。

　　130.步骤200、样本透明化：将样品依次放入所述试剂一、所述试剂二以及所述试剂三中分别进行缓和震荡预设时间，其中，所述试剂一、所述试剂二以及所述试剂三与实施例一相同，结合上述，样本透明化的详细步骤如下：

　　131.样本经过1xpbs洗涤后，放入10ml的1/2的所述试剂一中进行孵育，37℃条件下缓和震荡至少6小时；

　　132.将样本转移至10ml的所述试剂一中，37℃条件下缓和振荡6天，且每2天更换一次，共更换3次；

　　133.将样本转移至20ml的1xpbs中，室温缓和振荡洗涤2小时，重复洗涤至少3次；

　　134.样本经过洗涤后，放入10ml的1/2的所述试剂二中进行孵育，37℃条件下缓和震荡至少6小时；

　　135.将样本转移至10ml的所述试剂二中，37℃条件下缓和振荡6天，且每2天更换一次，共更换3次；

　　136.将样本转移至20ml的1xpbs中，室温缓和振荡洗涤2小时，重复洗涤至少3次；

　　137.样本洗涤后，放入10ml的1/2的所述试剂三中进行孵育，37℃条件下缓和震荡至少6小时；

　　138.样本经过孵育后，将样本转移至10ml的所述试剂三中，37℃条件下缓和振荡2天，

　　140.步骤300、样本成像：样本折射率匹配后，以wt/vol计，将2％的所述试剂三和低熔点琼脂糖充分混合并放至离心管中，直到琼脂糖粉末分布在溶液中；

　　141.加热离心管：将离心管放置在微波炉内加热预设时间，重复几次，直至溶液沸腾；

　　142.将凝胶溶液和样本移入容器中，移入的凝胶溶液用量至少达到样本厚度；

　　146.结合以上所述的方法以及图9和图10所示可知，利用本试剂盒和方法可以使得肾组织快速透明化，而且透明化后的组织利用光片显微镜可以做完整的三维成像。

　　147.此外，利用本技术提供了一种基于水性的生物组织透明化试剂盒及组织透明化方法对小鼠的肝脏组织、睾丸组织、肠组织以及脾脏组织进行透明化处理(对于透明化组织的对比图可参见图11至图14所示)，具体方法步骤与前述实施例的方法步骤相同，以及所采用试剂均相同，不同点仅在于在试剂一、试剂二以及试剂三中缓和振荡的时间不同：

　　149.将样本转移至10ml的所述试剂一中，37℃条件下缓和振荡5天，且每2天更换一次，共更换3次；

　　150.将样本转移至10ml的所述试剂二中，37℃条件下缓和振荡3天，且每2天更换一次，共更换2次；

　　151.样本经过孵育后，将样本转移至10ml的所述试剂三中，37℃条件下缓和振荡约2天左右，直至样本透明。

　　153.将样本转移至10ml的所述试剂一中，37℃条件下缓和振荡3天，且每2天更换一次，共更换2次；

　　154.将样本转移至10ml的所述试剂二中，37℃条件下缓和振荡3天，且每2天更换一次，共更换2次；

　　155.样本经过孵育后，将样本转移至10ml的所述试剂三中，37℃条件下缓和振荡约2天左右，直至样本透明。

　　157.将样本转移至10ml的所述试剂一中，37℃条件下缓和振荡2天，且每2天更换一次，共更换1次；

　　158.将样本转移至10ml的所述试剂二中，37℃条件下缓和振荡2天，且每2天更换一次，共更换1次；

　　159.样本经过孵育后，将样本转移至10ml的所述试剂三中，37℃条件下缓和振荡约1天左右，直至样本透明。

　　161.将样本转移至10ml的所述试剂一中，37℃条件下缓和振荡6天，且每2天更换一次，共更换3次；

　　162.将样本转移至10ml的所述试剂二中，37℃条件下缓和振荡6天，且每2天更换一次，共更换3次；

　　163.样本经过孵育后，将样本转移至10ml的所述试剂三中，37℃条件下缓和振荡约2天左右，直至样本透明。

　　164.可见，本技术提供的基于水性的生物组织透明化试剂盒和组织透明化方法适合于对多种组织进行透明化处理，适用范围交广。

　　165.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本技术的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本技术进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本技术各实施例技术方案的范围。

　　1.数字信号处理 2.传感器技术及应用 3.机电一体化产品开发 4.机械工程测试技术 5.逆向工程技术研究