基于水性的生物组织透明化97国际游戏app-试剂盒及组织透明化方法

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　　2.根据权利要求1所述的基于水性的生物组织透明化试剂盒，其特征在于，所述试剂一

　　所包括的尿素、四乙二胺以及Triton X‑100的质量‑体积浓度分别为25‑35、10‑30以及1‑5，

　　3.根据权利要求1所述的基于水性的生物组织透明化试剂盒，其特征在于，所述试剂二

　　所包括的N‑正丁基二乙醇胺以及Triton X‑100的质量‑体积浓度分别为10‑20以及10‑30，

　　4.根据权利要求1所述的基于水性的生物组织透明化试剂盒，其特征在于，所述试剂三

　　所包括的安替比林、烟酰胺以及N‑正丁基二乙醇胺的质量‑体积浓度分别为35‑50、20‑40以

　　5.一种组织透明化方法，其特征在于，应用于权利要求1至9中任一项所述的基于水性

　　步骤200、样本透明化：将样品依次放入所述试剂一、所述试剂二以及所述试剂三中分

　　6.根据权利要求5所述的组织透明化方法，其特征在于，所述步骤200包括如下步骤：

　　步骤201、样本经过1xPBS洗涤后，放入所述试剂一中进行孵育，在预设温度下缓和震

　　步骤202、将样本转移至所述试剂一中，在预设温度下缓和振荡，且每隔预设时间更换

　　7.根据权利要求5所述的组织透明化方法，其特征在于，所述步骤200包括如下步骤：

　　步骤204、样本经过洗涤后，放入所述试剂二中进行孵育，在预设温度下，缓和震荡；

　　步骤205、将样本转移至所述试剂二中，在预设温度下，缓和振荡，且按照每隔预设时间

　　8.根据权利要求5所述的组织透明化方法，其特征在于，所述步骤200包括如下步骤：

　　步骤207、样本洗涤后，放入所述试剂三中进行孵育，在预设温度下缓和震荡；

　　步骤208、样本经过孵育后，将样本转移至所述试剂三中，在预设温度下，缓和振荡，匹

　　9.根据权利要求5所述的组织透明化方法，其特征在于，所述步骤100包括如下步骤：

　　步骤102、PFA后固定：样本放在4％PFA中，而后在预设温度下，进行缓和震荡过夜。

　　10.根据权利要求5所述的组织透明化方法，其特征在于，所述组织透明化方法还包括

　　步骤300、样本成像：样本折射率匹配后，低熔点琼脂糖和所述试剂三充分混合并放至

　　加热离心管：将离心管放置在微波炉内加热预设时间，重复几次，直至溶液沸腾；

　　解读：如脑部神经投射、血管分布以及肿瘤微环境研究等，均需围绕三维空间信息才能得以

　　进行客观分析及后续研究。但是生物组织的不均匀性，如各层组织中含有的水、脂质和蛋白

　　质等各种分子造成光散射，以及细胞中的各类色素成分造成的光吸收，不仅限制了成像深

　　度，而且大大降低了图像的对比度，想要对组织进行三维成像仍是个很大的挑战。

　　泡或电泳等处理方式，去除造成光散射和光吸收的成分，然后应用高折射率介质使组织达

　　到近乎一致的折射率，从而使组织达到光学透明，进而增加成像深度和图像对比度。

　　透明化程度较高，但是刺激性强、组织收缩、容易使荧光淬灭。基于水凝胶的透明化方法(包

　　括CLARITY，SHIELD和PACT等)对蛋白质、核酸保护效果好，通常需要专用辅助设备，且所用

　　配套的商业试剂相对昂贵、对操作有一定要求。水性的组织透明化方法(如SeeDB,FRUIT,

　　Scale和CUBIC等)则生物相容性好、操作安全，具备满足现代医学检测要求的潜力，但是往

　　化方法，即具有高效、快速、操作简单、使用安全等优点，又能适用于各类组织样本透明化的

　　法，在一定程度上解决了现有技术中存在的一种符合现代医学检测要求的组织透明化方法

　　试剂二，所述试剂二包括N‑正丁基二乙醇胺以及Triton  X‑100；

　　在上述技术方案中，进一步地，所述试剂一所包括的尿素、四乙二胺以及Triton

　　在上述任一技术方案中，进一步地，所述试剂二所包括的N‑正丁基二乙醇胺以及

　　在上述任一技术方案中，进一步地，所述试剂三所包括的安替比林、烟酰胺以及N‑

　　正丁基二乙醇胺的质量‑体积浓度分别为35‑50、20‑40以及1‑5，且优选为50、20以及1。

　　的生物组织透明化试剂盒，因而，具有该基于水性的生物组织透明化试剂盒的全部有益技

　　步骤201、样本经过1xPBS洗涤后，放入所述试剂一中进行孵育，在预设温度下缓和

　　步骤202、将样本转移至所述试剂一中，在预设温度下缓和振荡，且每隔预设时间

　　步骤204、样本经过洗涤后，放入所述试剂二中进行孵育，在预设温度下，缓和震

　　步骤205、将样本转移至所述试剂二中，在预设温度下，缓和振荡，且按照每隔预设

　　步骤207、样本洗涤后，放入所述试剂三中进行孵育，在预设温度下缓和震荡；

　　步骤208、样本经过孵育后，将样本转移至所述试剂三中，在预设温度下，缓和振

　　步骤101、灌注、取材：麻醉小鼠后，先用ice  cold  1xPBS灌注心脏，然后用ice

　　步骤102、PFA后固定：样本放在4％PFA中，而后在预设温度下，进行缓和震荡过夜。

　　步骤300、样本成像：样本折射率匹配后，低熔点琼脂糖和所述试剂三充分混合并

　　加热离心管：将离心管放置在微波炉内加热预设时间，重复几次，直至溶液沸腾；

　　织快速脱色脱脂液，主要成分包含有尿素、四乙二胺、Triton  X‑100等试剂，样品经过该试

　　剂处理后会快速变成半透明状态；试剂二为组织进一步脱色脱脂液，主要成分包含有N‑正

　　丁基二乙醇胺、Triton  X‑100等试剂，可以使样本进一步进行脱色和脱脂；试剂三为组织透

　　明液，主要成分包含有安替比林、烟酰胺、N‑正丁基二乙醇胺等试剂，该试剂用于组织的折

　　射率匹配，经过该试剂处理后可以快速透明，而且透明化后的组织利用光片显微镜可以做

　　实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的

　　附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前

　　图1为小鼠脑透明化前和透明化后图片(其中，(a1)为透明化前，(b1)为透明化

　　图5为小鼠心脏透明化前和透明化后图片(其中，(a2)为透明化前，(b2)为透明化

　　图7为小鼠胃透明化前和透明化后图片(其中，(a3)为透明化前，(b3)为透明化

　　图9为小鼠肾脏透明化前和透明化后图片(其中，(a4)为透明化前，(b4)为透明化

　　图11为小鼠肝脏透明化前和透明化后图片(其中，(a5)为透明化前，(b5)为透明化

　　图12为小鼠睾丸透明化前和透明化后图片(其中，(a6)为透明化前，(b6)为透明化

　　图13为小鼠肠透明化前和透明化后图片(其中，(a7)为透明化前，(b7)为透明化

　　图14为小鼠脾脏透明化前和透明化后图片(其中，(a8)为透明化前，(b8)为透明化

　　下面将结合附图对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施

　　来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要

　　在本申请的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、

　　“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了

　　便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、

　　以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。此外，术语“第一”、“第二”、

　　在本申请的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相

　　连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可

　　以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是

　　两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本

　　下面参照图1至图11描述根据本申请一些实施例所述的基于水性的生物组织透明

　　步骤100、样本固定：灌注、取材：麻醉小鼠后，先用ice  cold1xPBS(指的是现有技

　　术中的冰冷的缓释液，具体是指温度在0‑4℃的缓释液)灌注心脏，然后用ice  cold  4％PFA

　　(冷的4％多聚甲醛固定液)灌流小鼠，直到血液灌流干净，且其中的样品指的就是小鼠脑；

　　PFA后固定：样本放在4％PFA中，而后在4℃条件下，进行缓和震荡过夜(12‑24小

　　时，是在摇床上进行的)，例如用1XPBS洗涤样本2‑3次，每次2小时，50rpm也即摇床的转速。

　　步骤200、样本透明化：将样品依次放入所述试剂一、所述试剂二以及所述试剂三

　　中分别进行缓和震荡预设时间，其中，试剂一为所述试剂一包括尿素、四乙二胺以及Triton

　　X‑100(聚乙二醇辛基苯基醚)，且质量‑体积浓度分别为30、30以及5，单位为g/mL；试剂二包

　　括N‑正丁基二乙醇胺以及Triton  X‑100，且质量‑体积浓度分别为15以及15，单位为mg/L；

　　试剂三包括安替比林、烟酰胺以及N‑正丁基二乙醇胺，且质量‑体积浓度分别为50、20以及

　　1，单位为mg/L，且注意：上述出现的质量‑体积浓度是指用单位体积(1毫升)溶液中所含的

　　溶质质量数来表示的浓度叫质量‑体积浓度，以符号g/mL表示。例如：1mL含铬废水中含铬的

　　质量为2克，则铬的质量‑体积浓度为2克/毫升(g/mL)，也即质量‑体积浓度＝溶质的质量数

　　样本经过1xPBS(是指现有技术中的常温状态下的缓冲液)洗涤后，放入10mL的1/2

　　将样本转移至10mL的所述试剂一中，37℃条件下缓和振荡6天，且每2天更换一次，

　　将样本转移至20mL的1xPBS中，室温缓和振荡洗涤2小时，重复洗涤至少3次；

　　样本经过洗涤后，放入10mL的1/2的所述试剂二中进行孵育，37℃条件下缓和震荡

　　将样本转移至10mL的所述试剂二中，37℃条件下缓和振荡6天，且每2天更换一次，

　　将样本转移至20mL的1xPBS中，室温缓和振荡洗涤2小时，重复洗涤至少3次；

　　样本洗涤后，放入10mL的1/2的所述试剂三中进行孵育，37℃条件下缓和震荡至少

　　样本经过孵育后，将样本转移至10mL的所述试剂三中，37℃条件下缓和振荡2天，

　　步骤300、样本成像：样本折射率匹配后，以wt/vol计，将2％的所述试剂三和低熔

　　加热离心管：将离心管放置在微波炉内加热预设时间，重复几次，直至溶液沸腾；

　　使用光片显微镜对样本进行完整三维成像。结合以上所述的方法以及图1至图4所

　　示可知，组织透明化试剂盒共包含三大试剂：试剂一为组织快速脱色脱脂液，主要成分包含

　　有尿素、四乙二胺、Triton  X‑100等试剂，样品经过该试剂处理后会快速变成半透明状态；

　　试剂二为组织进一步脱色脱脂液，主要成分包含有N‑正丁基二乙醇胺、Triton  X‑100等试

　　剂，可以使样本进一步进行脱色和脱脂；试剂三为组织透明液，主要成分包含有安替比林、

　　烟酰胺、N‑正丁基二乙醇胺等试剂，该试剂用于组织的折射率匹配，经过该试剂处理后可以

　　快速透明，而且透明化后的组织利用光片显微镜可以做完整的三维成像。可见，利用本试剂

　　盒和方法可以使得小鼠脑组织快速透明化，而且透明化后的组织利用光片显微镜可以做完

　　整的三维成像，可见，经过本试剂盒和方法获得的透明组织完全能够满足三维成像的需求。

　　步骤100、样本固定：灌注、取材：麻醉小鼠后，先用ice  cold1xPBS灌注心脏，然后

　　PFA后固定：样本放在4％PFA中，而后在4℃条件下，进行缓和震荡过夜(12‑24小

　　时，是在摇床上进行的)，例如用1XPBS洗涤样本2‑3次，每次2小时，50rpm也即摇床的转速。

　　步骤200、样本透明化：将样品依次放入所述试剂一、所述试剂二以及所述试剂三

　　中分别进行缓和震荡预设时间，其中，所述试剂一、所述试剂二以及所述试剂三与实施例一

　　样本经过1xPBS洗涤后，放入10mL的1/2的所述试剂一中进行孵育，37℃条件下缓

　　将样本转移至10mL的所述试剂一中，37℃条件下缓和振荡4天，且每2天更换一次，

　　将样本转移至20mL的1xPBS中，室温缓和振荡洗涤2小时，重复洗涤至少3次；

　　样本经过洗涤后，放入10mL的1/2的所述试剂二中进行孵育，37℃条件下缓和震荡

　　将样本转移至10mL的所述试剂二中，37℃条件下缓和振荡4天，且每2天更换一次，

　　将样本转移至20mL的1xPBS中，室温缓和振荡洗涤2小时，重复洗涤至少3次；

　　样本洗涤后，放入10mL的1/2的所述试剂三中进行孵育，37℃条件下缓和震荡至少

　　样本经过孵育后，将样本转移至10mL的所述试剂三中，37℃条件下缓和振荡约2天

　　步骤300、样本成像：样本折射率匹配后，以wt/vol计，将2％的所述试剂三和低熔

　　加热离心管：将离心管放置在微波炉内加热预设时间，重复几次，直至溶液沸腾；

　　结合以上所述的方法以及图5和图6所示可知，利用本试剂盒和方法可以使得心脏

　　步骤100、样本固定：灌注、取材：麻醉小鼠后，先用ice  cold1xPBS灌注心脏，然后

　　PFA后固定：样本放在4％PFA中，而后在4℃条件下，进行缓和震荡过夜(12‑24小

　　时，是在摇床上进行的)，例如用1XPBS洗涤样本2‑3次，每次2小时，50rpm也即摇床的转速。

　　步骤200、样本透明化：将样品依次放入所述试剂一、所述试剂二以及所述试剂三

　　中分别进行缓和震荡预设时间，其中，所述试剂一、所述试剂二以及所述试剂三与实施例一

　　样本经过1xPBS洗涤后，放入10mL的1/2的所述试剂一中进行孵育，37℃条件下缓

　　将样本转移至10mL的所述试剂一中，37℃条件下缓和振荡2天，且每2天更换一次，

　　将样本转移至20mL的1xPBS中，室温缓和振荡洗涤2小时，重复洗涤至少3次；

　　样本经过洗涤后，放入10mL的1/2的所述试剂二中进行孵育，37℃条件下缓和震荡

　　将样本转移至10mL的所述试剂二中，37℃条件下缓和振荡2天，且每2天更换一次，

　　将样本转移至20mL的1xPBS中，室温缓和振荡洗涤2小时，重复洗涤至少3次；

　　样本洗涤后，放入10mL的1/2的所述试剂三中进行孵育，37℃条件下缓和震荡至少

　　样本经过孵育后，将样本转移至10mL的所述试剂三中，37℃条件下缓和振荡约1天

　　步骤300、样本成像：样本折射率匹配后，以wt/vol计，将2％的所述试剂三和低熔

　　加热离心管：将离心管放置在微波炉内加热预设时间，重复几次，直至溶液沸腾；